一种提取人尿黄体生成素的方法<%=id%>

颁证日：
优先权：
申请(专利权)人：上海天伟生物制药有限公司
地址： 201108上海市莘庄工业区申强路588号
发明 (设计)人：梅民权;郑扶桑
国际申请：
国际公布：
进入国家日期：
专利代理机构：上海智力专利事务所
代理人：瞿承达
摘要
　本发明公开一种提取人尿黄体生成素的方法。本发明的特征是首先采集人尿黄体生成素粗品，其次选用Q-Sepharose FF进行阴离子交换层析，层析条件选为0.01M Tris缓冲液，pH9.5，0～1M NaCl线性梯度洗脱，收集含人尿黄体生成素组分，超滤脱盐，再次选用 -Sepharose FF进行阳离子交换层析，层析条件选为0.01M NaAc，pH5.2，0～1M NaCl线性梯度洗脱，收集含人尿黄体生成素组分，超滤脱盐；然后使用phenyl-Sepharose FF进行疏水层析，层析条件选为0.01M Tris缓冲液，1M NaCl，pH7.2，用1M～0M NaCl线性梯度洗脱，收集含人尿黄体生成素组分，超滤浓缩；最后使用Sephadex G-100凝胶过滤，进行分子筛凝胶层析将人尿黄体生成素与残存的杂蛋白分开，流动相为0.02M NH₄Ac，pH7.0，收集含人尿黄体生成素的活性组分，冷冻干燥得到高纯度人尿黄体生成素。以用于临床治疗。
主权项
　权利要求书 1.一种提取人尿黄体生成素的方法，其特征是从绝经后尿促性腺素或人尿黄体生成素粗品中提取出高纯度的人尿黄体生成素，绝经后尿促性腺素或人尿黄体生成素粗品是由绝经后健康妇女尿液经过高岭土吸附、乙醇抽提、硅酸铝吸附后制得，绝经后尿促性腺素或人尿黄体生成素粗品的生物效价为从每毫克1国际单位至300国际单位，首先用适当的阴离子交换层析和阳离子交换层析的方法对绝经后尿促性腺素或人尿黄体生成素粗品进行初步纯化，阴离子交换层析，阴离子交换层析的层析介质的活性基团可以为二乙基氨基乙基(DEAE)、二乙基季胺(Q)、二乙基羟丙基季(QAE) 之类，载体为琼脂糖(Sepharose)、葡聚糖(Sephadex)和纤维素 (Cellulose)之类，以Q-Sepharose为优，层析条件为pH 4.0 ～10.0，离子强度为0.01M～0.5M NaCl或KCl，采用0～1M NaCl或KCl线性梯度洗脱、分部收集或分段洗脱，合并人尿黄体生成素活性部分，阳离子交换层析，层析介质的活性基团可以为磺酸基(S)、磺酸丙基( )、羧甲基(CM)之类，载体可以选为琼脂糖(Sepharose)、葡聚糖(Sephadex)以及纤维素( Cellulose)之类，以 -Sepharose为优，层析条件为pH 3.8～ pH 7.5，离子强度为0.01M～0.5M NaCl或KCl，采用0～1M NaCl或KCl线性梯度洗脱、分部收集或分段洗脱，合并人尿黄体生成素活性部分，阳离子交换层析或阴离子交换层析的顺序可以互换，也可以只选用其中一种层析方法，其次用疏水层析方法进一步纯化，介质为phenyl-sepharose或octyl-sepharose或butyl- sepharose，以phenyl-Sepharose为优，层析条件为pH4-8，溶液含0.5-2M NaCl或(NH4)2SO4，以NaCl为优，洗脱用降低盐浓度的方法作梯度洗脱或分段洗脱，分部收集含人尿黄体生成素的部分，上述从阴离子交换层析、阳离子交换层析及疏水层析方法中获得的收集液的处理，可以用冷冻干燥或用丙酮、乙醇等有机溶剂沉淀方法获得适于进一步纯化用的干物质，也可以用超滤等方法浓缩脱盐，直接用于后续工艺，以乙醇沉淀方法为优，沉淀时乙醇的终浓度为70～90％，以80％为优，最后用分子筛凝胶层析方法将人尿黄体生成素与残存的杂蛋白分开，分子筛凝胶为G-75或G- 2 100，凝胶骨架为Sephadex或Superdex，也可以是Sephacryl S- 100，以Sephadex G-100为最优，层析条件为pH4～8，缓冲液含0～0.5M NaCl，紫外检测流出，分部收集，合并含人尿黄体生成素活性部分，超滤脱盐、浓缩，冷冻干燥，也可以加入无水乙醇至终浓度为70～90％沉淀蛋白质，沉淀以80％为优，本步干燥以冻干为优，按以上方法获得的人尿黄体生成素，可以按照已知的方法制成冻干制剂，制剂含有适当的赋形剂，可以是甘露醇、乳糖、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖或它们的混合物，也可含有适当的保护剂，如人血白蛋白，经过以上步骤从绝经后尿促性腺素或人尿黄体生成素粗品中提取得到的人尿黄体生成素，生物效价在每毫克5000～ 15000国际单位，人尿黄体生成素与尿促卵泡素生物活性的比例大于100∶1。 3

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