用于T-A克隆的T载体制备方法<%=id%>

.. 理.. 人：. 汤志武王鹏翔
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. 摘要　.
.本发明公开了用于T-A克隆的T载体制备方法，选择一个高拷贝数的常用质粒，以此质粒为模板设计四对引物，通过定点突变构建两种在特定序列有差异的突变质粒；在两种突变质粒的多克隆位点处分别构建TTTTAAA及TTTAAAA 序列盒，并分别引入两个不同的酶切位点BamHI和HindIII；将突变质粒分别导入细菌扩增，并将扩增的等量质粒用可识别TTTAAA序列的内切酶切割，混合、变性、复性，反应后的混合物酶切，去除亲本分子，即可分离出T载体。本发明采用独特的生物合成技术生产T载体，这种由生物合成的天然T载体，具有合成方便，生产成本低，克隆效率高，质量稳定等特点，用本方法构建的T载体完成了多个基因的克隆，结果表明其重组效率达到了90％以上。
. 主权项　.
.1、用于T-A克隆的T载体制备方法，其特征在于： (1)选用高拷贝数的常用质粒，以此质粒为模板，设计四对引物，通过定点突变构建两种在特定序列有差异的突变质粒；在两种突变质粒的多克隆位点处分别构建TTTTAAA及TTTAAAA序列盒，并在距离TTTTAAA及TTTAAAA 序列盒位点较远的位置，分别引入两个不同的酶切位点BamHI和HindIII； (2)将两种突变质粒分别导入细菌扩增，并将扩增的等量pNTv1和pNTv2 用可识别TTTAAA序列的内切酶切割，形成两种线性质粒； (3)将酶切后的两种质粒纯化，然后混合、变性、复性杂交，产生四种分子，其中有两种为亲本分子，另两种为新的杂合分子；这两种杂合分子在原来 BamHI和HindIII酶切位点处存在不配对区域，即BamHI和HindIII酶切位点被破坏，其中一种杂合分子在其3′端形成具有单个T突出的线性载体； (4)用BamHI和HindIII两种限制性内切酶切割混合质粒； (5)酶切后的混合物进行分离，去除两种亲本分子，分离出两种杂合分子，其中具有单个T突出的线性载体杂合分子是用于T-A克隆的T载体。.
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