利用基因化学诱导调控系统提高重组真菌安全性的方法<%=id%>

菌源的化学物质(如昆虫蜕皮激素、高等哺乳动物糖皮质激素)为诱导物的基因表达化学诱导系统引入真菌，加入诱导物，外源基因表达，不加诱导物，外源基因不表达，对其基因表达实现精确控制，以同步解决重组菌株的基因高效表达与安全性问题。
主权项
　权利要求书 1、一种利用基因化学诱导调控系统提高重组真菌安全性的方法，其特征在于，依次包括下列步骤： (1)组成型表达调控蛋白GVGEc的真菌表达载体的构建 ①用BamHI从含有调控蛋白GVGEc的载体pMF6GRVP16HecR上，切下并回收 2.2kb的、编码调控蛋白的基因片段GRAct-VP16-GRDBD-HecR； ②BamHI酶切 MTn载体，并去磷酸化，该载体含有构巢曲霉(A ergillius nidula )3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的组成型启动子PgpdA，以及色氨酸基因的终止子TtrpC； ③将上述步骤①中的GRAct-VP16-GRDBD-HecR片段连入步骤②中的去磷酸化 MTn载体，选择正向插入的克隆，得到中间载体 -P-GVGEc-T； ④用XbaI/HindIII从上述 -P-GVGEc-T载体上切下5.2kb的 PgpdA-GVGEc-TtrpC片段，回收； ⑤上述步骤④的片段连入用XbaI/HindIII处理的真菌表达载体 ANF-Bar中，得到组成型表达调控蛋白GVGEc的真菌表达载体 ANF-Bar-PGVGEcT，该表达载体以抗除草剂基因bar作为选择标记基因，转化真菌后用除草剂筛选转化子； (2)真菌中受蜕皮激素诱导的诱导型启动子的构建 ①通过对构巢曲霉(A ergillius nidula )3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的组成型启动子PgpdA，进行启动子分析，确定其Minimal启动子(MP)的序列；Minimal启动子的全序列如下，全长85 ； CTCTTTTCTTTTCTCTTTCTTTTCCCATCTTCAGTATATTCATCTTCCCATCCAAGAACCT TTATTTCCCCTA ②设计酶切位点，合成MP5’端引入HindIII、BglII位点(AAGCTTAGATCT)，3’ 端引入SmaI位点(CCCGGG)，完成后的MP序列为： AAGCTTAGATCTCTCTTTTCTTTTCTCTTTCTTTTCCCATCTTCAGTATATTCATCTTCCC ATCCAAGAACCTTTATTTCCCCTACCCGGG ③将上述MP寡聚核苷酸双链用HindIII/SmaI双酶切之后，连入含色氨酸基因终止子TtrpC的载体Xa-TtrpC，该载体Xa-TtrpC同样也用HindIII/EcoRV处理，由此得到含MP和TtrpC的中间载体pXa-MP-TtrpC； ④将目的基因插入pXa-MP-TtrpC，得到中间载体pXa-MP-GUS-TtrpC； ⑤用HindIII/BamHI从p222.1GRE6载体上切下163 的GRE序列，该序列含有 6个重复拷贝的GRE，全序列如下： AAGCTTCGACTGTACAGGATGTTCTAGCTACTCGAGTAGCTAGAACATCCTGTACAG 2 TCGAGTAGCTAGAACATCCTGTACAGTCGACTAGCTAGAACATCCTGTACAGTCG AGTAGCTAGAACATCCTGTACAGTCGAGTAGCTAGAACATCCTGTACAGGATCC ⑥将上述GRE酶切片段连入HindIII/BglII酶切的pXa-MP-GUS-TtrpC载体，得到含目的基因的、真菌中特异启动的、受蜕皮激素诱导的启动子载体 pXa-GREMP-GUS-TtrpC； (3)最终表达载体的构建 ①将(2)-⑥中构建的载体pXa-GREMP-GUS-TtrpC，用HindIII单酶切，回收 3.0kb的GREMP-GUS-TtrpC片段； ②用HindIII单酶切(1)-⑤中得到的真菌表达载体 ANF-Bar-PGVGEcT，去磷酸化处理； ③将上述①、②中的片段连接，选择两个启动子顺向连接的克隆，就得到最终所需的、用于转化真菌的表达载体 ANF-bar-GVGEc-GERMP-GUS； ④将上述 ANF-bar-GVGEc-GERMP-GUS载体转化农杆菌，再通过农杆菌介导的方法转化真菌，筛选获得重组的菌株； ⑤重组真菌加入蜕皮激素(如RH5992，2mg/mL)诱导下游基因表达，未加诱导物的不表达。 3

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