利用侵染相关基因的协同作用提高微生物杀虫效果的方法<%=id%>

协同作用提高微生物杀虫效果的方法，将虫生真菌侵染昆虫时分泌的两类主要水解酶：类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶基因克隆，并将二者分别置于真菌、细菌或植物组成性启动子之下，然后串联于真菌、细菌或植物表达载体上，构建类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶基因的双价表达载体。利用遗传转化技术将双价表达载体分别转入虫生真菌、杀虫细菌或杀虫病毒，获得同时高效表达类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶的重组菌株，使二者在微生物侵染昆虫时协同作用，提高菌株毒力；或者将双价载体转入植物，获得同时表达类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶的转基因植株，使二者在植物中协同作用，提高植株的抗虫能力。
主权项
　权利要求书 1、一种利用侵染相关基因的协同作用提高微生物杀虫效果的方法，其特征在于，依次包括下列步骤： (1)球孢白僵菌(Beauveria ba iana)类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因 Chit-1基因克隆 ①球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的cDNA基因克隆利用昆虫体壁诱导球孢白僵菌分生孢子萌发后的芽管状物，提取RNA，纯化 mRNA，构建cDNA文库，同时，根据对不同来源的类枯草蛋白酶基因的同源性比较结果，按其中2个保守序列设计引物，上游引物 -1(forward primer)的序列为：5′＞tgg ggt cta ggt cgc atc tc＜3′；下游引物 -2(reverse primer)的序列为：5′＞gcc agg tgc gaa aat gtc aac＜3′，然后利用RT-PCR技术扩增出大小为593 的类枯草杆菌蛋白酶探针，利用此探针筛选cDNA文库，获得阳性克隆，释放文库，酶切验证，测序验证，获得大小为1557 的CDEP-1 cDNA基因(polyA 除外)； ②球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的基因克隆根据CDEP-1 cDNA 5′端和3′端序列设计引物，以球孢白僵菌的基因组DNA为模板扩增CDEP-1的基因组序列，上游引物序列为：5′＞ctt cat cca gca agc aaa gtc＜3′，下游引物序列为：5′＞gtt aaa tat aca gat caa tga gtt ttg＜3′； ③球孢白僵菌内切几丁酶 chitl的分离纯化及序列测定在利用几丁质诱导培养球孢白僵菌的基础上，分离纯化出具有内切酶活性的几丁酶 chitl，并进行N’端氨基酸测定，序列为：AGTCATKGRPAGKVLQGYWENWD； ④球孢白僵菌内切几丁酶 chitl的cDNA的克隆提取利用几丁质诱导的球孢白僵菌总RNA，根据N’端氨基酸序列设计上游兼并引物，结合下游加接头的Oligo-dT引物，利用3′RACE扩增出编码几丁酶 chitl的 cDNA序列； ⑤球孢白僵菌内切几丁酶基因 chitl的克隆根据3’RACE得到的cDNA序列，利用YADE技术扩增 chitl的全长基因，用于YADE的线性扩增引物序列为：5’＞ccg tgc ttg cga atg tcg＜3’，指数扩增引物序列为：5’＞ggc acc gtc cca gtt ctc＜3’，以DraI酶切球孢白僵菌的基 2 因组DNA为模板，YADE扩增得到了长为1400 的片段，连接3’RACE和YADE的产物，得到 chitl的全长基因序列； (2)蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因 Chit-1双价载体的构建将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因 chitl分别置于构巢曲霉 (A ergillius nidula )3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子Pgpd和色氨酸基因的终止子TtrpC之下，然后将二者串联于真菌表达载体，构建成双价基因的真菌表达载体，或将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因 chitl串联于原核表达系统，构建成双价基因的原核表达载体，或将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因 chitl分别置于植物组成性启动子如35sCAMV和Nos终止子之下，然后将二者串联于植物表达载体，构建成双价基因的植物表达载体； (3)获得同时超量表达蛋白酶CDEP-1和几丁质酶 Chit-1重组微生物或抗虫植物利用遗传转化技术，将构建的双价载体转入虫生真菌或其它杀虫微生物或植物，筛选获得同时组成性超量表达蛋白酶CDEP-1和几丁质酶 Chit-1的高毒力重组微生物或抗虫植物。 3

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