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1．掌握凋亡细胞的形态特征。
2．学会根据染色质的凝集程度、是否形成凋亡小体和细胞膜通透性变化，鉴别凋亡细胞、坏死细胞及正常细胞。
细胞死亡分为2种类型：程序性细胞死亡或称凋亡和坏死。凋亡细胞的的膜保持完整性，但染色质高度凝集，有些凝集块附着于核膜上，使细胞和核的外形发生改变，并产生出大小不同被膜包围的凋亡小体；正常细胞的膜保持完整，且染色质较均匀分布；坏死细胞的膜损伤，染色质凝集程度远低于凋亡细胞。
本实验用荧光探针PK和Ho．33342对细胞进行双标记，来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。荧光探针PK(碘化丙啶)是双链核酸的标记物，可嵌入双链DNA或双链RNA中，PK不能穿过完整细胞的膜，只能进入膜有损伤的细胞，因此可标记坏死细胞，而不能标记正常细胞和凋亡细胞。它的激发光谱与发射光谱的峰值分别是535n圆和617nm，实际应用时从紫外到绿光都可作为激发光，坏死细胞的核显现出很强的枯红色荧光。荧光探针Ho．33342是一种特异性DNA标记物，主要结合于A—T碱基区，由于它的亲脂性，可进入活细胞中标记DNA(也可标记死细胞)，因此它对正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞都可进行标记。由于它的激发光谱与发射光谱的峰值分别是350nm和461 nm，当用紫外光激发时，可见到正常细胞和凋亡细胞都发射明亮的蓝色荧光，因坏死细胞被标记的PI桔红色荧光远远强于Ho．33342的蓝色荧光，所以从颜色上很容易将坏死细胞从细胞群体中区分出来。又可在发蓝色荧光的细胞群体中根据染色质的凝集程度和是否有凋亡小体区分出正常细胞和凋亡细胞。注意在体外凋亡细胞放置较长时间，膜也会损伤，变成为坏死细胞，显现出PK桔红色荧光。
三尖杉酯碱(hntringtonine，HT)是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病、急性单核白血病等有良好疗效的抗癌药物。根据方敏等“三尖杉酯碱对人早幼粒白血病HL—60细胞杀伤模式”的研究，表明HT在0．02-5~／mt．范围内作用2h，即可诱导HL—60细胞程序性死亡，表现出典型的凋亡细胞的形态和生化特征。
***仪器： 荧光显微镜，C02培养箱，超净工作台，倒置显微镜和离心机等。
***材料： HL—60细胞(用含10％小牛血清的 RPMl 1640 培养基，在37℃和5％CO2条件下培养)，微量加样器(1μL-1 mL)，0．5mL和1．5mL的Eppendod管(微量离心管)，20μL、200μL 和1 mL吸头，10mL培养瓶，载玻片，盖玻片等。
***试剂： TiT浓度为1 μg／ml．的针剂(购自北京中国医学科学院药厂)；荧光探针：用PBS(pH 7.4)将P1配成500vs／mL的储液，用蒸馏水将Ho．33342配成1μg／mL的储液，2种储液都在—20笔冻存(PK和Ho．33342都购自北京鼎国生物技术发展中心)。
1．在超净台中进行无菌操作。实验前约24h，接种3瓶HL—60细胞，每瓶含6mL培养基。在37℃，5％C0)培养箱中培养。
2．当细胞密度达到70％-80％时(对数生长期)，每瓶约有10s个细胞。用无菌小直管离心(1 000r／rain，Stain)收集细胞(盖瓶塞)，弃上清，分别用6m1．培养基重悬细胞，用移液管轻轻将细胞悬液移回原培养瓶中，分别进行处理：1号瓶(对照组)加入PBS(pH 7．46ml；2号瓶(加药组)加入HT储液6flL，使HT终浓度为'vs／mL；3号瓶不加任何试剂 (这组细胞用于本实验·中二、HT诱导HL—60细胞凋亡的生化特征观察的坏死组，可通过高温或微波处理使细胞坏死)。
3．加药后放人培养箱培养2．5h。
4．从1号培养瓶中取出178μL细胞悬液加到1号微量离心管(对照组)中；从2号培养瓶中取出178μL细胞悬液加到2号微量离心管(加药组)中。
5．向2个微量离心管中都加入两种荧光探针：Ho．33342储液加2μL(终浓度为10μg/mL)；PK储液加20PL(终浓度为50μg/mL)，混匀，37℃沮箱中标记20-30mino
6．将2微量离心管1 000 r／rain，离心5 min，弃上清，加适量PBS重悬浮细胞，再1·000r／min，离心5min，余少量上清(约20μL)悬浮细胞(用手指弹微量离心管底)。
7．从微量离心管1(对照组)取10PL细胞悬液，滴加到载玻片上，盖上盖玻片。从微量离心管2(加药组)取10PL细胞悬液，滴加到载玻片上，盖上盖玻片。两组各作2张片于，都作好标记，保存于暗盒中。
8．在荧光显微镜下，先用透射光观察(最好用相差显微镜观察)，找到焦面后，再用紫外光激发，40x荧光物镜观察。根据荧光的颜色和细胞的形态进行记录，应看到对照组中的细胞核质均匀，发蓝色荧光；加HT组分3种情况：很多凋亡细胞出现染色质凝集、边缘化，有凋亡小体，发蓝色荧光；也有些正常细胞与对照组相同，还有少量细胞为坏死细胞，发红色荧光。
9．3个培养瓶中余下的细胞，留做琼脂糖凝胶电泳实验。
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根据你的观察，填表2—12—1，细胞形态一栏要求画出你所观察到的典型细胞图像。
正常细胞
调亡细胞
坏死细胞
荧光颜色
细胞形态
所占百分比
1．荧光标记的细胞悬液滴片时，注意载玻片要清洁，悬液量要充满于整玻片下，但不要产生气泡，多余的要用滤纸条从整片边缘吸去，否则细胞将漂浮运动，不易观察。
2．两种荧光探针的储液都分装在微量离心管中，-20℃冻存，用前在室沮下融化，荧光探针的储存和标记都要保持在暗环境中。紫外光是强激发光，极易漂白荧光。可在荧光观察前，先用透射光找到细胞焦面，再关掉透射光照明，开启紫外光激发样品。
1．总结凋亡细胞的形态特征。
2．试述本实验鉴别凋亡细胞、坏死细胞和正常细胞的原理。
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