引物设计有几条基本原则

首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应(即错配)。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度、产物长度、序列Tm值、△G值（内部稳定性）、引物二聚体及发夹结构、错配（错误引发位点），引物及产物GC含量，有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。在使用引物设计软件设计引物时应遵循以下的要点：1. 一般引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp，过长或过短都不合适。2. 引物3’-端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。3. 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。4. 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。5. △G 值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标，一般情况下，引物的内部稳定性曲线最好呈正弦曲线形状，即5’-端和中间部分△G值较高，而3’-端△G值相对较低，且不要超过9 kcal/mol（△G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错配。分析其原理，引物与模板应具有较高的结
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