研究探讨RNA-seq数据分析方法

高通量RNA测序（RNA-seq）有望描绘出转录组的整体图像，实现样本内所有基因及其亚型的完整注释和定量。随着测序价格的不断下降，以及个人化测序仪的上市，更多的实验室有机会尝试这种新技术。然而，测序之后的数据分析才是真正的挑战。在RNA-seq之后，还需要一些强大的计算工具，才能绘制出完整的转录组图谱。在这一期的《自然—方法学》（Nature Methods）上，来自MIT和哈佛Broad研究院的研究人员发表了一篇综述，介绍了转录组注释和定量的计算方法。首先，他们介绍了一些方法，将读数与参考转录组或基因组直接比对。之后，他们讨论了鉴定表达基因和亚型的方法。最后，他们还介绍了一些方法，来预计基因和亚型的丰度，以及分析样品间的差异表达。由于RNA-seq数据生成的不断改善，现有计算工具的发展有着很大差异。在某些领域，如读数定位，有多种算法存在，但在差异表达分析上，解决方案才刚刚出现。作者们强调了这些方法的核心原理和每种方法的关键差异，以及它们在RNA-seq分析上的应用。他们还讨论了这些不同的方法如何影响结果以及数据的阐释。为了方便读者参考，他们还将现有的方法列成了一张表，注明了它们的原理和用途。另外，他们精选了一些有代表性的方法，应用在已经发表的RNA-seq数据组中。此数据组包含了5800万个末端配对的读数。数据比对是RNA-seq分析中的一项基本任务，然而也面临着一些挑战，比如数据量大，读数很短（36-125 bp），错误率可观，且许多读数跨越外显子-外显子交界。对于RNA-seq的比对方法，作者将其分成“unspliced read aligners”和“spliced aligners” 两类，并分别介绍。转录组重建也是个很困难的任务，因为基因表达差异很大，且读数可能来源于成熟的mRNA，也可能来源于未完全剪接的前体RNA，这样就很难鉴定成熟的转录本。当然，读数短也为分析带来了困难。目前的转录组重建方法主要有两类，一类是基因组指导的，另一类是不依赖于基因组的。作者比较了这两类方法，并具体介绍了每一类下面的几种方法。至于转录组的图谱分析，DNA芯片一直是首选方法。在使用RNA-seq来估计基因表达时，需要将读数适当地标准化，才能提取出有意义的表达预测值。作者介绍了一些方法，来预计基因和亚型的丰度，以及分析样品间的差异表达。作者还提到，随着测序技术的成熟，如读长不断增加，现有的计算工具需要发展，也能满足新的需求，同时新工具也会不断出现，满足新的应用。（来源：生物通薄荷）